期刊：Chemical research in toxicology
影响因子：4.1
主要技术：MC-seq，RNA-seq，LC-MS
导语
紫外线 A(UVA: 315−400 nm)和紫外线 B(UVB: 280−315 nm)作为化学因素，会诱发包括黑色素瘤在内的皮肤肿瘤的发生发展。目前研究表明表观遗传学修饰可以调节体内 ROS 稳态。过于研究证明了 ROS 调控会影响黑色素瘤在内的各种癌症的发展和转移。
科学问题
本文课题组过去研究表明，长期 UVB 照射可以改变 SKH- 1 小鼠表皮组织的 DNA CpG 的甲基化状态，该甲基化改变会影响癌症相关通路，包括：PTEN、p53、Nrf2 和炎症通路的信号传导。然而，紫外线辐射所诱发的皮肤肿瘤，其发生的机制当前仍然不清楚，其对应的表观遗传的调控尚不明晰。
研究技术
MC-seq，RNA-seq，LC-MS
方法
在这项研究中，本文使用液相色谱 - 质谱（LC-MS)、DNA 甲基化测序和 RNA 测序检测了暴露于 UVB 的 HaCaT 细胞（人类角质形成细胞系）的分子改变；同时设计萝卜硫素（Sulforaphane, SFN)处理组，考察 SFN 对 UVB 皮肤损伤的治疗作用。
结论
UVB 会驱动角质形成细胞产生代谢重组、表观遗传学重编程和转录组改变；而 SFN 会阻断或减弱许多这些畸变。表明 SFN 对 UVB 诱导的皮肤损伤的整体保护作用。
研究结果
1. 构建 UVB 长期诱导的 HaCaT 分株并检测其整体特征
本文为了研究检测 SFN 治疗对 UVB 暴露后的代谢重编。实验用 HaCaT 细胞株设计了 3 个模型组，分别为：短期处理组：UVB_3h（10 mJ/cm2 紫外线照射后 3 小时）、UVB_6h（10 mJ/cm2UVB 照射后 6 小时）；长期处理组 10wk-UVB HaCaT（10 mJ//cm2 紫外线照射每周一次，持续 10 周）。基于短期和长期的分组，再考察 SFN 对代谢组的影响。主成分分析（PCA）显示，10wk-UVB HaCaT 分株（UVB 长期处理组）的代谢产物和短期诱导的分组差异显著，而 SFN 处理也会导致显著的代谢物差异。为了研究 SFN 处理或 UVB 长期照射对 HaCaT 细胞中基因表达谱改变的影响，设计应用转录组测序进行检测。PCA 分析显示，分组间差异显著。
2. UVB 及 SFN 诱导 HaCaT 细胞的代谢变化
基于差异的代谢物分析富集的通路，UVB 短期暴露后改变的代谢产物主要影响：精氨酸和脯氨酸代谢、柠檬酸循环、嘌呤代谢、苹果酸 - 天冬氨酸穿梭、尿素循环以及氨循环；UVB 长期暴露后改变的代谢产物主要影响乳糖合成、淀粉和蔗糖代谢、核苷酸糖代谢、精氨酸和脯氨酸代谢以及糖酵解。
SFN 处理后也分析了富集的功能和通路，结果显示 SFN 处理 10wk-UVB HaCaT 细胞后，变化的代谢产物主要影响磷脂酰胆碱生物合成、雌酮代谢、淀粉和蔗糖代谢以及心磷脂生物合成。有趣的是，结果发现一些 UVB 调节的代谢产物可以被 SFN 逆转。代谢物如：N- 乙酰基亮氨酸、次黄嘌呤、3- 甲基 -2- 氧代戊酸酯和肌酸被 UVB 激活，但 SFN 处理后被抑制。代谢产物如精氨酸琥珀酸盐、脯氨酸和天冬酰胺被 UVB 抑制，但 SFN 处理后会重新激活。
3. SFN 和 UVB 可引起 HaCaT 细胞转录组改变，SFN 可逆转 UVB 引起的转录组改变
针对 HaCaT 细胞株设计 SFN 处理组和 DMSO 对照组。根据差异基因进行富集分析，结果显示 SFN 激活“氧化还原稳态”和“炎症相关”的通路，包括：NRF2 介导的氧化应激反应、IL- 6 信号传导和神经炎症信号传导。“免疫通路”同样被 SFN 激活，如 Toll 样受体信号和 TREM1 信号；而 CD40 信号则被 SFN 抑制。
针对 HaCaT 细胞株设计 UVB 长期诱导组（10wk-UVB HaCaT)和对照组。对照组相比，10wk UVB-HaCaT 细胞的 NF-κB 信号和 TGF- β 信号上调。结果表明，UVB 长期诱导会激活“光老化”及“光致癌相关”的反应，如；基质金属蛋白酶（MMPs)、肿瘤微环境途径和 HIF1α 氧化还原信号。
基于构建的 10wk-UVB HaCaT 分株，考察 SFN 的调控作用。UVB 处理后会抑制一些功能通路包括：骨关节炎通路、STAT3 通路、心肌肥大信号通路（增强作用）、MMP 酶的抑制作用等；而 SFN 处理后该抑制被解除。UVB 处理同时也会激活一些功能通路包括：大肠癌癌症转移通路、HOTIAR 调节途径和固有凝血酶原激活途径；但 SFN 处理后该激活效果被抑制。除此之外，MMP1、MMP10、MMP12、MMP13 和 MMP16 这些基因都被 UVB 激活，但在 SFN 处理后激活的作用也同样被抑制。
4. SFN 处理 10wk-UVB HaCaT 引起 DNA 甲基化的变化
为了研究表观对机制的参与，设计进行了 DNA 甲基测序，以研究 UVB 诱导和 SFN 处理是否会改变 DNA CpG 的甲基化特征。结果显示启动子区域包含大量差异甲基化区域（DMRs)。从整体分布考察，启动子区域的平均甲基化水平低于其他区域。在 10wk-UVB HaCaT 细胞中，SFN 处理组共逆转了 18 个 DMR，这 18 个 DMR 相关基因包括 ALOX15(15- 脂氧合酶 -1)、ZNF765(锌指蛋白 765)、OR13C8(嗅觉受体家族 13 亚家族 C 成员 8)、MIR4288(小 RNA 4288)和 CDHR1(钙粘蛋白相关家族成员 1)。
5. CpG 甲基化、RNA 表达和代谢物之间的相关性。
首先通过四象限图展示 DMRs 和基因表达的关系，结果显示个别基因在 UVB+SFN 与 UVB 分组中存在反比的调控关系。其次通过“基因 - 代谢物”相互作用网络分析，可视化功能相关代谢物和基因之间的相互作用。UVB 诱导的 DEGs 其下游产生的代谢产物主要为三磷酸腺苷和 ADP；而在 UVB+SFN 组中，受 SFN 调节的 DEGs 其下游产生的代谢产物主要为一磷酸腺苷和 5′- 二磷酸尿苷。
为了研究代谢和表观遗传学过程之间的相互作用，实验最后研究了 SFN 和 UVB 对特定代谢产物、DNA 甲基转移酶和组蛋白去乙酰酶的影响。本文发现，SFN 处理和 UVB 照射 6 小时增加了正常 HaCaT 细胞中 S - 腺苷甲硫氨酸（SAM)和 SAM/SAH(S- 腺苷同型半胱氨酸，SAH)的比例。SFN 和 UVB 刺激均增加了 ATP 水平，而 SFN 增加了 ATP 与 ADP 的比例。SFN 显著下调 DNMT3B(甲基化转移酶）的表达。10wk -UVB 可以使 HDAC5(组蛋白去乙酰酶）和 SIRT7(组蛋白去乙酰酶）的表达下调，但使 HDAC9 和 SIRT5 表达上调。SFN 显著下调 HDAC6 和 HDAC11 的表达，上调 HDAC9 和 SIRT1 的表达。这些都表明 UVB 和 SFN 会调控组蛋白的修饰酶表达从而实现对下游基因表达和代谢物的调控。
参考文献：
Li S, Dina Kuo HC, Wang L, Wu R, Sargsyan D, Kong AN. UVB Drives Metabolic Rewiring and Epigenetic Reprograming and Protection by Sulforaphane in Human Skin Keratinocytes. Chem Res Toxicol. 2022;35(7):1220-1233. doi:10.1021/acs.chemrestox.1c00432
